聚合酶鏈反應(PCR)產(chǎn)物是指通過特定的引物和酶在模板DNA上進行擴增的DNA片段。這種產(chǎn)物是特定的DNA序列的拷貝,通常由一對引物指導DNA聚合酶沿模板DNA合成。具有廣泛的生物學應用價值,且其純化和分析需要考慮多種因素以確保實驗的準確性和可靠性。
目前主流的實時熒光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)方法分為染料法和探針法,染料法以SYBRGreen法為代表,SYBRGreen染料游離時熒光微弱,但但一旦與雙鏈DNA結合后,熒光大大增強,反應管中的熒光強度與反應管中雙鏈DNA的數(shù)量成正比例關系,因此熒光定量pcr實驗步驟可以通過檢測熒光計算反應管中產(chǎn)生的雙鏈DNA(PCR產(chǎn)物)的量,但該方法沒有特異性,非特異性擴增的產(chǎn)物也會被計入。
閾值循環(huán)數(shù) Threshold cycle (Ct) 也寫作Cq值,熒光信號大于熒光閾值時PCR循環(huán)數(shù)。儀器軟件通常將第3-15個循環(huán)的熒光值設為基線(baseline),是由于測量的偶然誤差引起的。閾值(threshold)一般是基線的標準偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調(diào)節(jié)。高于閾值的熒光信號被認為是真實的信號,用于定義Ct值。Ct會受到閾值的影響,每次試驗由于樣品和儀器的不同會導致基線不同,進而影響閾值和Ct值。